Sekvensointi

Sekvensointi.

Sekvensointi on menetelmä, jolla selvitetään makromolekyylin sekvenssi eli esimerkiksi nukleiinihapon nukleotidijärjestys tai polypeptidin aminohappojärjestys. Useimmiten käsitteellä tarkoitetaan nimenomaan DNA:n sekvenssin määrittämistä.

DNA:n sekvensointi

Pääartikkeli: DNA:n sekvensointi

Kaikki DNA:n sekvensointimenetelmät pohjautuvat eripituisten DNA-fragmenttien muodostumiseen. Ensimmäiset sekvensointimenetelmät olivat 1970-luvulla kehitetyt Maxam-Gilbertin menetelmä ja Sangerin menetelmä, joista jälkimmäinen on yleisin menetelmä vielä 2000-luvullakin.

Maxam-Gilbertin menetelmä

Maxam-Gilbertin sekvensointimenetelmä perustuu tiettyjen kemikaalien reagoimiseen tiettyjen emästen kanssa. DNA laitetaan tällöin neljään eri kemikaalia (DMS, metaanihappo, hydratsiini, NaCl + hydratsiini) sisältävään koeputkeen. DNA pilkkoutuu tällöin vain tiettyjen emästen kohdalta. Pilkkoutumisen määrää voidaan säätää kemikaalipitoisuuksilla ja reaktioajoilla. Maxam-Gilbertin menetelmä on työläs ja siinä käytetään myrkyllisiä kemikaaleja. Sitä käytetään yleensä vain jos Sangerin menetelmä ei sovellu.

Sangerin menetelmä

Sanger sekvensoinnin periaate. 1. Sekvensoitavaa DNA:ta monistetaan PCR-menetelmällä. Juosteet erotetaan toisistaan kuumentamalla. Alukkeita lisätään seokseen ja seos jaetaan neljään osaan. Kuhunkin seokseen lisätään kaikkia tavallisia nukleotideja ja polymeraaseja. Lisäksi kukin seos saa vain yhdentyyppisiä leimattuja nukleotidejä. 2. PCR toistetaan kullekin astialle, mutta leimattu nukleotidi päättää monistumisen ennenaikaisesti ja saadaan eripituisia leimattuja DNA-pätkiä. 3. Pätkät erotottuvat niiden massan mukaan joko kapillaarissa ja ne havaitaan tietokoneella tai erottuminen tapahtuu geelissä ja pätkät havaitaan silmämääräisesti. Leimat osoittavat kunkin emäksen sekvenssissä ja sekvenssi saadaan selville.

Sangerin menetelmä on yleisin sekvensointimenetelmä. Se edellyttää DNA:n avaamista yksijuosteiseksi. Avaamiseen käytetään usein polymeraasiketjureaktiota (PCR). PCR:n ja Sangerin menetelmän yhdistelmää kutsutaan sykliseksi sekvensoinniksi.

Kun DNA-pätkät on aukaistu yksijuosteisiksi, niihin liitetään radioaktiivisesti tai fluoresoivasti merkityt alukkeet. Alukkeen sisältävät pätkät jaetaan neljään eri koeputkeen. Koeputkissa on DNA:ta monistavaa polymeraasientsyymiä, tavallisia nukleotideja (A, G, T, C) ja kussakin yhden tyyppisiä muunneltuja nukleotideja, dideoksinukleotideja. Muunnellut nukleotidit pysäyttävät DNA:n kahdentumisen. Tällöin kussakin koeputkessa synteesi katkeaa tietyn (muunnellun) nukleotidin kohdalta (A,G,T tai C) sen mukaan, mitä muunneltuja nukleotideja koeputki sisältää. Vaikka koeputki sisältäisikin tietyn nukleotidityypin muunneltuja nukleotideja, siihen voi liittyä myös normaali nukleotidi. Se mahdollistaa eripituisten sekvenssien syntymisen. Eripituiset sekvenssit erotellaan geelielektroforeesilla ja niiden perusteella muodostetaan käsitys sekvenssin emäsjärjestyksestä.

Lähteet

• Sekvensointi Solunetti. Viitattu 9.10.2007.

Aiheesta muualla

• Kuvia tai muita tiedostoja aiheesta Sekvensointi Wikimedia Commonsissa

• Chiu, K. P. (2015). Next-generation sequencing and sequence data analysis. Sharjah: Bentham Science Publishers, Limited.

• Kokkonen, S., Nowak, A., Veistola, S., Vilkki, J. & Vilkki, J. (2011). Lukion biologia: [5], Bioteknologia. Helsinki: Otava.